全基因組范圍基因敲除gRNA文庫（GeCKO v2.0）
金斯瑞提供專利引進于Broad研究所張峰實驗室的，能實現Human和Mouse細胞基因組范圍CRISPR敲除的gRNA文庫（GeCKO ），能夠在Human或Mouse細胞中快速產生功能缺失的突變體并且篩選所期望的表型。運用GeCKO文庫可以在人或小鼠的基因組內敲除任何表達基因及miRNA等非表達的基因。GeCKO 文庫允許客戶在不同的條件下鑒定任何細胞功能必須的基因，篩選何種基因的缺失會使癌細胞具有耐藥性。 GeCKO 文庫已經被廣泛使用于原代的人或小鼠細胞，干細胞，癌細胞及各種穩定細胞系。 GeCKO v2.0作為升級版的GeCKO文庫，加入非靶向gRNA作為對照，同時用于轉導的慢病毒載體也同步進行了升級，以便更高效的富集病毒和提升病毒在原代細胞的轉染效率。
GeCKO v2.0文庫針對每個基因設計了6條gRNA序列，但為了降低后續轉染和篩選工作量的壓力將GeCKO v2.0文庫分成兩個文庫，文庫A和文庫B。每個文庫包含針對每個基因的3個gRNA，以及1,000個非靶向的對照性gRNA。A文庫還包含針對miRNA的gRNA（每個miRNA有4個gRNA）。為了確保針對每個基因的gRNA的完整表達，可以同時購買A文庫和B文庫混合后使用；但如果細胞樣品和后續高通量篩能力有限，建議可以僅使用文庫A進行篩選。
更多GeCKO文庫設計、構建信息，請參考張峰實驗室發表的文獻：Sanjana N.E., Shalem O., Zhang F.?Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening.?Nat Methods.?2014 Aug;11(8):783-4. doi: 10.1038/nmeth.3047.
文庫信息
| 文庫 |
序列信息 |
| Human Library A |
65,383 sequences:
- 靶向19,050個基因，每3條gRNA靶向1個基因；
- 1,864個miRNA，每4條gRNA靶向1個miRNA；
- 1000條對照（非靶向性）gRNA。
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| Human Library B |
58,028 sequences:
- 靶向19,050個基因，每3條gRNA靶向1個基因；
- 1000條對照（非靶向性）gRNA。
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| Mouse Library A |
67,405 sequences:
- 靶向20,611個基因，每3條gRNA靶向1個基因；
- 1,175個miRNA，每4條gRNA靶向1個miRNA；
- 1000條對照（非靶向性）gRNA。
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| Mouse Library B |
62,804 sequences:
- 靶向20,611個基因，每3條gRNA靶向1個基因；
- 1000條對照（非靶向性）gRNA。
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金斯瑞GeCKO v2.0文庫交付形式和使用方法
GeCKO v2.0文庫中每一個gRNA都被克隆進優化的慢病毒載體，與輔助細胞共轉染293細胞后可形成高滴度的病毒, 最終gRNA序列可在目的細胞中實現高效轉錄。
完成病毒包裝的GeCKO v2.0文庫應與目的細胞進行較低的MOI進行轉染，以確保進入單個細胞的gRNA數量不超過1個。在完成轉染后，開始篩選工作之前，應進行一輪NGS深度測序，評估細胞池中gRNA的表達情況。在篩選結束后再進行第二輪NGS深度測序，并對數據進行分析, 確定篩選過程中丟失或富集的gRNA序列。
參考文獻：Julia Joung et.al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protoc. 2017 Apr;12(4):828-863
GeCKO文庫交付規格
- 文庫（轉染級）以25μg為一個單位量。100μg 及200μg文庫分別是以4 x 25μg或者8 x 25μg形式交付。
- 提供項目報告及二代測序驗證的統計摘要及COA 文件，如您需要，還可提供完整可用的NGS原始數據。
