CRISPR被認為是研究和發現藥物的強大的工具，可以在不引入外來DNA的情況下，以高度定向的方式改變任何細胞中的任何基因。CRISPR/Cas9相對于以前的基因編輯形式，如TALENs和鋅指核酸酶(ZFN)的優點是，它更容易操作，并且在執行雙等位基因修改方面具有更高的效率。
金斯瑞提供基于GenCRISPR™的基因編輯服務，可以使用任何哺乳動物細胞系，針對任何基因生產基因編輯的細胞。
金斯瑞提供多種CRISPR基因編輯細胞系，依托優勢的化學合成長單鏈sgRNA，可采用編輯效率高、毒性低的RNP遞送體系，同時支持慢病毒、質粒多種遞送體系，為您提供指定目的基因、編輯區域和細胞的基因編輯細胞系服務。
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| 服務類型 | 服務詳情 | 細胞系選項* | 交付內容** | 交付周期 |
|---|---|---|---|---|
| EZ knock-out 細胞系服務 |
單基因knock-out穩定細胞系 |
90+種常見適合轉染的細胞系（包括A549, CHO-K1, HT-29, MDA-MB-231, 4T1, A20, HCT116, MCF7, MDCK, U937, RPMI 8866等） |
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9~15周 |
| 定制化knock-out 細胞系服務 |
單基因或多基因knock-out穩定細胞系 |
任何癌細胞系 |
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12~19周 |
| 全長基因敲除 細胞系服務New |
敲除整個基因片段 |
50+種常見適合轉染的細胞系（包括A549, CHO-K1, HEK293, HEK293T, HT-29, MDA-MB-231, 4T1, A20, HCT116, MCF7等） |
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12~20周 |
| Knock-out 細胞池服務 |
單基因knock-out細胞系 |
任何細胞系 |
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5-11周 |
| 定制化knock-in 細胞系服務 |
任意基因組位置插入或修飾基因 |
任何癌細胞系 |
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14-24周 |
| 定制化篩選和 脫靶效應檢測New |
利用全基因組文庫或定制化文庫篩選目的基因 利用iGUIDE進行潛在脫靶效應檢測 |
任何癌細胞系 |
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詳詢 |
*一般由客戶提供細胞系，如果金斯瑞提供細胞系，則需額外收費。且金斯瑞不提供原代細胞、干細胞或IPS細胞的基因編輯服務。
**根據要求在mRNA或蛋白水平驗證全等位基因修飾細胞系。兩周一次的項目更新。
可選服務
| 附加服務 | 詳情 |
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| 逆轉錄PCR（RT-PCR） | 通過RT-PCR進行測序，驗證敲除克隆在CDS上插入缺失標記的mRNA水平。 |
| Western blot | 通過WB驗證敲除克隆，必須在宿主細胞中提供與靶蛋白（RNAi或敲除）特異性結合的有效抗體。 |
| FACS分析 | 通過FACS驗證敲除克隆，必須在宿主細胞中提供與靶蛋白（RNAi或敲除）特異性結合的有效抗體。 |
| 啟動子活性分析 | 宿主細胞中啟動子（Cbh/CMV/EFS）的活性分析提升gRNA-Cas9的切割效率。 |
| 轉染方法優化 | 難轉染細胞轉染方法的分析提升gRNA-Cas9的切割效率。 |
| 脫靶分析 | 通過對前5個潛在的脫靶位點進行測序來確定基因敲除克隆 |
| 附加單克隆 | 從同一個細胞庫中挑選出另外一個單克隆發給客戶。 |
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基因或蛋白功能研究
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模型構建
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藥物篩選與開發
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IVD研究
案例分析1
- 在4號外顯子中通過插入缺失，敲除人類結腸癌細胞HCT116中的K-ras位點，如圖1所示。
- 對Cas9和gRNA遞送顆粒進行慢病毒包裝，HCT116細胞進行病毒滴度優化。對每個單克隆進行Sanger測序，選擇K-ras基因在第4號外顯子上敲除的純合子，如圖2所示。
- 通過Western Blot方法驗證所選克隆中K-ras基因表達缺失，如圖3所示。
圖1：K-ras敲除方法
圖2：親代細胞和K-ras-/- HCT116細胞sanger測序
圖3：K-ras敲除蛋白表達驗證
案例分析2
- 設計并合成gRNA，以靶向GS等位基因上的特定區域。用該載體轉染DG44細胞，并通過Sanger測序分析細胞池。
- 獲得了幾個單克隆并進行Sanger序列分析。一個單克隆包含移碼突變（圖1）。
- 分析GS敲除克隆的GS蛋白表達（圖2）。
- 為了評估功能喪失，在有或沒有谷氨酰胺濃度增加的情況下培養GS敲除克?。?b>圖3）。在沒有谷氨酰胺的情況下GS敲除克隆不能生長。在增加谷氨酰胺時GS敲除克隆生長，因此確定GS敲除細胞系的功能缺失。
- 總之，成功靶向GS產生的單克隆已完全驗證GS功能的缺失。
圖1：GS等位基因缺失引起移碼突變
圖2：在GS敲除細胞裂解液中，anti-GS抗體未檢測到谷氨酰胺合成酶
圖3：DG44(GS-/-)的L-谷氨酰胺依賴性
案例分析3
- 設計一對gRNA靶定基因組上的基因進行全基因缺失。使用GenCRISPR™技術優化gRNA對，對Jurkat細胞的切割效率最大（圖1）。
- 配對的gRNAs共轉染到Jurkat細胞中，并通過FACS分選富集。通過PCR評估缺失效率，根據條帶灰度計算，轉染細胞池占21%（圖2）。
- 采用高通量PCR方法篩選到了200個單克隆，并通過Sanger測序和RT-PCR驗證全等位基因缺失克?。?b>圖3）。
圖1
圖2：PCR驗證gRNA對
圖3：缺失克隆篩選
相關服務
- 金斯瑞還提供 GenCRISPR™ gRNA質粒構建服務，您只需提供靶向基因序列，即可為您精心設計gRNA序列（此項免費），合成并克隆至您指定的任何載體中。
- 金斯瑞提供 CellPower™過表達穩定細胞系構建服務，幫助您開發外源表達目的基因的穩定細胞系。
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